2 × In-Fusion klonēšanas mikss

 

Produkta nosaukums	kat. Nē.	Spec.
2 × In-Fusion klonēšanas mikss	G3350-20T	20 T
	G3350-100T	100 T

 

 

2 × In-Fusion Cloning Mix ir paredzēti ātrai, virzītai viena vai 2–3 vairāku DNS fragmentu klonēšanai jebkurā vektorā, īpaši piemērots vienam fragmentam. Tas efektīvi un precīzi apvieno DNS fragmentus (piemēram, PCR ģenerētus ieliktņus un linearizētus vektorus), atpazīstot 15-bp pārklāšanos to galos. Šīs 15-bp pārklāšanās var izveidot, izstrādājot primerus vēlamo secību pastiprināšanai.

Premikss nav atkarīgs no ligāzes sistēmas, kas ievērojami samazina vektora pašligācijas fonu, un tam nav jāņem vērā restrikcijas endonukleāzes vieta, kas atrodas pašā ievietotajā fragmentā. Viena fragmenta klonēšanai vektorā iegūto pozitīvo klonu īpatsvars sasniedz pat 99%. Izmantojot maisījumu, visas darbības var pabeigt bez termostata iekārtām, sākot no DNS parauga sagatavošanas līdz plāksnes transformētām šūnām dažu stundu laikā.

 

 

Kuģis ar slapju ledu; veikalā -20 grāds, derīgs 12 mēnešus.

 

 

Komponents	G3350-20T	G3350-100T
2 × In-Fusion klonēšanas mikss	100 μL	5×100 μL
pUC19 (linearizēts, kontroles vektors, 5 ng/μL)	10 μL	10 μL
Kontroles ieliktnis (10 ng/μL)	10 μL	10 μL
Rokasgrāmata	Viens eksemplārs

 

 

Veikt nosiešanas reakciju

1. Autoklāvā apstrādātā 1.5-ml mikrocentrifūgas mēģenē pievienojiet šādu (ieteicams 10-uL reakcijas sistēmu):

Komponents	Apjoms
2 × In-Fusion klonēšanas mikss	5 μL
Vektora DNS	X μL
Ievietojiet DNS	Y μL
Ūdens bez nukleāzes	Pievieno 10 μL

2. Viegli samaisiet un īsi centrifugējiet, lai saturs nonāktu mēģenes apakšā.

3. Inkubējiet ledus ūdens vannā (ledus ūdens maisījums) 5 - 10 minūtes.

4. Novietojiet mēģeni uz ledus un nekavējoties turpiniet, lai veiktu transformācijas reakciju. Vai arī varat uzglabāt ligēšanas maisījumu –20 grādu temperatūrā, līdz esat gatavs.

Veikt transformācijas reakciju

5. Pievienojiet atbilstošu ligāšanas maisījumu ķīmiski kompetentām šūnām (piemēram, E.coli DH5, E.coli Top10 utt.) un samaisiet, viegli piesitot. Nejauciet ar pipeti uz augšu un uz leju. Atlikušos ligēšanas maisījumu(s) var uzglabāt -20 grādu temperatūrā.

5. Inkubējiet 30 minūtes uz ledus.

6. Inkubējiet tieši 90 sekundes 42 grādu ūdens vannā. Nejaukt un nekratīt.

7. Izņemiet centrifūgas mēģenes no 42 grādu vannas un novietojiet tās uz ledus uz 2-5 minūtēm.

8. Pievienojiet 900 µL SOC vai LB barotnes. Lai izvairītos no piesārņojuma, ir jāizmanto sterila tehnika. Centrifūgas mēģeni(-es) kratīt 37 grādu temperatūrā 1 stundu ar 225 apgr./min kratīšanas inkubatorā.

9. Izklājiet atbilstošu tilpumu no katras transformācijas centrifūgas mēģenes uz atsevišķām, marķētām LB agara plāksnēm. Atlikušo transformācijas maisījumu var uzglabāt 4 grādu temperatūrā un, ja nepieciešams, izklāt nākamajā dienā.

10. Apgrieziet plāksni(-es) otrādi un inkubējiet 37 grādu temperatūrā nakti.

Analizējiet transformantus

11. Atlasiet kolonijas un analizējiet ar plazmīdu izolāciju, PCR vai sekvencēšanu.

 

 

1. Vektora DNS un ieliktņa DNS ir jāattīra ar gēlu un jāanalizē to kvalitāte un koncentrācija ar elektroforēzi. Ja koncentrācija ir zema, ligēšanas reakcijā ūdeni var izlaist.

2. The Tm value between the overlapping regions of multiple fragments should be consistent and >60 grādi.

3. Ieteicams, lai vektora un ieliktņa molārā attiecība būtu 1:1 ~ 1:3; kad 2-3 fragmenti ir savienoti, molārā attiecība starp katru fragmentu ir 1:1, un ligācijas reakcijas sistēmu var palielināt vienādās proporcijās.

4. Ja vektora un ieliktņa kopējais tilpums ir lielāks par 5 μL, varat mērogot ligācijas sistēmu līdz 20 μL.

5. Ligācijas produkta tilpums nedrīkst pārsniegt 1/10 no kompetento šūnu tilpuma, pretējā gadījumā transformācijas efektivitāte tiks ievērojami samazināta. Ligācijas produkta un kompetento šūnu tilpumu var palielināt vienādās proporcijās (piemēram, 20 μL ligācijas sistēmas pārveido 200 μL kompetento šūnu).

6. 2×Universal Ligation Mix jāuztur -20 grādu temperatūrā līdz 5-10 minūšu laikā pēc lietošanas un nekavējoties jāatgriež -20 grādam pēc lietošanas. Ieteicams sasaldēt alikvotās daļās, lai samazinātu sasaldēšanas-atkausēšanas ciklus.

7. Ja transformācijai izmanto elektroporāciju, vektora DNS un inserta DNS jāattīra ar kolonnas metodi vai etanola izgulsnēšanas metodi.

 

 

Tikai pētniecībai!

 

 

Populāri tagi: 2 × in-fusion klonēšanas maisījums, Ķīna 2 × in-fusion klonēšanas maisījumu ražotāji, piegādātāji, rūpnīca