Click-iT EdU-488 šūnu izplatīšanas noteikšanas komplekts

 

produkta nosaukums	Produkta identifikācija	modelis
Click-iT EdU-488 šūnu izplatīšanas noteikšanas komplekts	G1601	100T

 

 

Šūnu proliferācijas spēju analīze ir izplatīta un svarīga novērtēšanas metode dzīvības zinātnēs. Tas var spriest par noteiktu gēnu, zāļu utt. ietekmi uz šūnām, kas kultivētas in vitro, vai analizēt audu šūnu augšanas un atjaunošanās spēju dažādos apstākļos vai stimulācijā. Pašlaik ir daudzas metodes, lai noteiktu šūnu proliferāciju. Lielākā daļa no tām izmanto dažus šūnu ražotus vielmaiņas enzīmus, lai netieši novērtētu šūnu proliferācijas aktivitāti (piemēram, CCK-8 metode, MTT metode utt.), bet dažas zāles vai pašas šūnas stāvoklis noteikti ietekmēs novērtējuma rezultātus. Tieša DNS sintēzes noteikšana šūnās, lai noteiktu šūnu proliferāciju, ir atzīta par precīzāko un efektīvāko noteikšanas metodi. Tomēr gan sākotnējai radioaktīvi iezīmētai nukleozīdu iekļaušanas metodei, gan tai sekojošajai BrdU metodes uzlabošanai, kuras pamatā ir antivielu noteikšana, ir savi ierobežojumi.

EdU (5-etinil-2'-dezoksiuridīns, 5-etinil-2'-dezoksiuridīns) ir timidīna analogs, kas satur acetilēna grupu, ja to injicē dzīvniekiem vai inkubē šūnas, kas kultivētas In vitro šīs mazās molekulas var ātri izkliedēties dažādos orgānos un audos, infiltrēties šūnās un aizstāt timidīnu (T) tikko sintezētā DNS šūnu proliferācijas laikā. Acetilēna grupa EdU molekulā var reaģēt ar fluorescējoši iF488 iezīmēto azīda savienojuma zondi, veidojot stabilu triazola gredzenu zem vara jonu katalīzes, tāpēc tikko sintezēto DNS var marķēt ar atbilstošo fluorescējošu zondi. Salīdzinot ar radioaktīvi iezīmētu nukleozīdu iekļaušanas metodi, EdU noteikšanas metodei nav tādu ierobežojošu faktoru kā radioaktīvais piesārņojums; salīdzinot ar BrdU noteikšanas metodi, EdU noteikšanas metodei nav nepieciešama DNS denaturācija vai antigēna-antivielu reakcija, kas ievērojami samazina eksperimenta sarežģītību un arī padara eksperimentu laiku taupīgāku, jutīgāku, stabilāku un precīzāku.

Šo komplektu var izmantot, lai noteiktu šūnu proliferāciju kultivētās šūnās vai dzīvnieku audos. Šajā komplektā esošā fluorescējošā zonde ir zaļā fluorescence, maksimālais ierosmes viļņa garums ir 491 nm un maksimālais emisijas viļņa garums ir 516 nm. Pēc tam, kad proliferējošās šūnas ir marķētas, šūnas kodols parādīs spilgti zaļu fluorescenci, un šūnas kodols tiks kopīgi marķēts ar atbilstošu parasto kodolkrāsu (šis komplekts nodrošina Hoechst 33342 šūnu kodolkrāsu), varat izmantot fluorescences mikroskopu, lāzera konfokālo mikroskopu. un citi instrumenti, lai tieši novērotu šūnu proliferāciju; varat arī izmantot plūsmas citometriju, lai noteiktu kultivēto šūnu fluorescences intensitāti in vitro, un pēc tam noteikt šūnu ciklu, pamatojoties uz fluorescences intensitātes DNS replikācijas aktivitāti vidējā S fāzē.

 

 

Reaģents B (krāsviela iF488) jāuzglabā -20 grādu temperatūrā prom no gaismas;

EdU katalītisko reaģentu (Reaģents A) un reakcijas buferi var uzglabāt 4 grādu temperatūrā;

Derīgs 12 mēnešus.

 

 

Komponenta numurs	Komponents	G1601-100T
G1601-1	EdU uzglabāšanas šķīdums (10 mM)	100 μL
G1601-2	Reaģents A	120 μL
G1601-3	Reaģents B (krāsviela iF488)	50 μL
G1601-4	Reaģents C	2 × 100 mg (pulveris)
G1601-5	reakcijas buferis	20 ml
G1601-6	Hoechst 33342 krāsošanas šķīdums	30 μL
Rokasgrāmata		1 gab

Piezīme. Iepriekš minētie reakcijas laiki attiecas uz atbilstošo 96-iedobes plāksnes testu.

 

 

1. Šūnu barotne, kas satur serumu;

2. Caurlaidības šķīdums: 0.2-0.5% Triton X-100 PBS (iesakiet mūsu produktu, Cat. Nr.: G1204);

3. Fiksācijas šķīdums: 4% paraformaldehīds PBS, pH 7,4 (iesakiet mūsu produktu, Cat.#:G1101);

4. PBS buferis (iesakiet mūsu produktu, Cat.#:G4202);

5. Ultratīrs ūdens;

6. Ar dzīvnieku modelēšanu un audu sadalīšanu saistīti reaģenti (dzīvnieku audu šūnu proliferācijas tests).

 

 

1. Kultivētu šūnu pirmapstrāde in vitro:

1.1. Vienmērīgi iestādiet šūnas šūnu kultūras plāksnē noteiktā blīvumā (stādīšanas blīvumu nosaka tādi faktori kā šūnu lielums, augšanas ātrums utt.). Pēc tam, kad šūnas ir pielipušas pie sienas vai atgriežas normālā stāvoklī, veiciet atbilstošu zāļu stimulāciju un citas procedūras. (Attiecībā uz suspensijas šūnām, lūdzu, ievērojiet parasto suspensijas šūnu darbības metodi. Visā eksperimentā ir jāpievieno centrifugēšana un citas darbības).

1.2. Katalītisko piedevu (reaģentu C) centrifugēja ar mazu ātrumu, paņēma 100 mg un izšķīdināja, pievienojot 1 ml īpaši tīra ūdens, un izdalīja un uzglabāja -20 grādu temperatūrā, atlikušo pulveri paturēja kā rezervi.

 

2. In vitro šūnu EdU marķēšana, fiksācija un permeabilizācija:

2.1. Sagatavojiet 2×EdU inkubācijas darba šķīdumu: pievienojiet 2 μL EdU uzglabāšanas šķīdumu (10 mM) katram 1 ml pilnīgas šūnu kultivēšanas barotnes, kas ir 20 μM 2 × EdU inkubācijas darba šķīdums, un ievietojiet to inkubatorā, lai uzsildītu (ieteikums EdU darba koncentrācija ir 10 μM provizoriskajiem eksperimentiem);

2.2. Puses maiņas režīmā aspirējiet pusi no sākotnējās šūnu barotnes kultivēšanas plāksnē un pievienojiet vienādu tilpumu iepriekš uzkarsēta 2 × EdU inkubācijas darba šķīduma un inkubējiet noteiktu laiku (inkubācijas ilgums parasti ir atkarīgs uz atbilstošo šūnu augšanas ciklu, kas parasti veido aptuveni 10% no šūnu cikla. Pārsvarā pielipušām un ātri augošām šūnām ieteicams inkubēt apmēram 2 stundas. Konkrētiem gadījumiem tas jāpielāgo atbilstoši šūnu īpašībām, faktiskajai situācijai pēc apstrādes utt. Ja nepieciešams ilgāks inkubācijas laiks, EdU darba koncentrāciju var atbilstoši samazināt uz īsāku laiku, var attiecīgi samazināt EdU koncentrāciju palielināts);

2.3. Pēc EdU inkubācijas mazgā ar PBS buferšķīdumu 1-2 reizes, pievieno fiksējošo šķidrumu, lai nosegtu šūnas, un fiksē istabas temperatūrā 15 minūtes (ja nepieciešama plūsmas citometrija, adherentās šūnas ir jāsagremo un atkārtoti suspendē pirms šīs darbības. salabot, ievērot suspensijas šūnu apstrādes metodi); Mazgāt 2-3 reizes ar PBS buferšķīdumu, 3-5 min katru reizi;

2.4. Noņemiet PBS buferšķīdumu, pievienojiet permeabilizācijas šķīdumu, lai pārklātu šūnas, un inkubējiet istabas temperatūrā 15 minūtes;

2.5. Noņemiet permeabilizācijas šķīdumu, mazgājiet 1-2 reizes ar PBS buferšķīdumu, 3-5 min katru reizi. Pēc tam pārejiet uz 4. darbību.

 

3. Dzīvnieku EdU injekcijas modelēšana, kā arī audu sekciju apstrāde:

3.1. Saskaņā ar eksperimentālajām prasībām, vienu vai vairākas EdU injekcijas izmanto, lai modelētu dzīvniekus ar intraperitoneālu injekciju, intramuskulāru injekciju, subkutānu injekciju, injekciju astes vēnā utt. Parasti EdU devas attiecība pret dzīvnieka ķermeņa svaru ir 5 mg/kg, faktiskā injekcijas deva ir atkarīga no pētījuma satura un dzīvnieku apstākļiem. Šajā komplektā iekļautais EdU uzglabāšanas risinājums galvenokārt tiek izmantots šūnu EdU marķēšanai in vitro. Ja nepieciešams modelēt dzīvnieku ar EdU, varat pasūtīt EdU reaģentu atsevišķi (kat. Nr.: G5059);

3.2. Epitēlija šūnas, piemēram, tievās zarnas, ātri vairojas, bet smadzeņu šūnas proliferējas lēni. Ātrāk augošo audu marķēšana parasti aizņem mazāk nekā 12 stundas, savukārt lēnāk augošo audu marķēšana var aizņemt vairākas dienas. Optimālais marķēšanas laiks tika noteikts saskaņā ar konkrēto eksperimentu. Zarnu epitēlija audu straujās proliferācijas dēļ šādi audi tika ieteikti kā atsauce marķēšanai.

3.3. Pēc tam, kad dzīvnieks ir nonāvēts saskaņā ar noteiktajiem standartiem, tiek izņemti nepieciešamie audi un tiek izgatavotas saldētas sekcijas vai parafīna sekcijas saskaņā ar parastajām procedūrām:

a. Saldētām sekcijām: atgrieziet sekcijas līdz istabas temperatūrai, pievienojiet atbilstošu daudzumu fiksācijas šķidruma un fiksējiet istabas temperatūrā 15 minūtes. Noņemiet fiksējošo šķidrumu un mazgājiet 3 reizes ar PBS buferšķīdumu katru 3-5 min; noņemiet PBS buferšķīdumu un pārklājiet audus ar atbilstošu daudzumu permeabilizācijas šķīduma un inkubējiet istabas temperatūrā 10-15 min; noņemiet permeabilizācijas šķīdumu un mazgājiet ar PBS buferšķīdumu 1- 2 reizes, 3-5 min katru reizi. Pēc tam pārejiet uz 4. darbību.

b. Parafīna sekcijām: deparafinējiet un rehidrējiet sekcijas un 5 minūtes mazgājiet ar PBS. Noņemiet PBS buferšķīdumu, pievienojiet permeabilizācijas šķīdumu, lai pārklātu šūnas vai audus, un inkubējiet istabas temperatūrā 15 minūtes; Pēc tam mazgājiet ar PBS buferšķīdumu 1-2 reizes, katru reizi 3-5 min. Pēc tam pārejiet uz 4. darbību.

 

4. Edu klikšķa reakcija:

4.1. Šūnu vai audu fiksācijas un perforācijas laikā, reakcijas šķīduma pagatavošana: sajauciet reaģentus atbilstoši šādai attiecībai, preparāta tilpumu var palielināt vai samazināt proporcionāli paraugu skaitam.

 

Komponents	Skaļums (šūnai)	Apjoms (histoloģiskajai sadaļai)
reakcijas buferis	935 μL	928 μL
Reaģents A	10 μL	10 μL
Reaģents B (krāsviela iF488)	5 μL	12 μL
Reaģents C	50 μL	50 μL
kopējā jauda	1000 μL	1000 μL

 

4.2. No šūnām vai sekcijām izņem PBS buferšķīdumu, pievieno reakcijas šķīdumu, viegli sakrata, lai nodrošinātu, ka reakcijas šķīdums pārklāj visas šūnas vai audus, un inkubē 30 minūtes istabas temperatūrā tumsā;

4.3. Noņemiet reakcijas šķīdumu, mazgājiet 2-3 reizes ar PBS buferšķīdumu, 3-5 min katru reizi (ja nav citu īpašu prasību, fluorescences intensitāti var noteikt ar plūsmas citometriju vai fluorescences efektu var noteikt, izmantojot citi instrumenti).

 

5. Kodoltraips (pēc izvēles):

5.1. Atšķaida Hoechst 33342 krāsošanas šķīdumu ar PBS buferšķīdumu attiecībā 1:500-1000, pievieno paraugam, lai pārklātu šūnas, un inkubē 5 minūtes;

5.2. Noņemiet Hoechst 33342 krāsošanas šķīdumu, mazgājiet 2-3 reizes ar PBS buferšķīdumu, 3-5 min katru reizi.

6. Attēlveidošanas un noteikšanas analīze:

Izmantojiet fluorescences mikroskopu vai konfokālo mikroskopu, lai noteiktu apstrādātās šūnas vai audu sekciju paraugus un analizētu proliferējošo šūnu proporciju. Alternatīvi var savākt in vitro kultivētās šūnas un izmērīt fluorescences intensitāti ar plūsmas citometriju (ieteicams izmantot šūnu paraugus, kas nav marķēti ar EdU, kā negatīvu kontroli plūsmas citometrijas testam un izvēlēties piemērotu spriegumu), un uz fluorescences intensitātes var noteikt S-fāzes DNS replikācijas aktivitāti šūnu ciklā. Fluorescējošā krāsviela iF488 (reaģents B) šajā komplektā atbilst Ex/Em spektrālajam raksturojumam: 491 nm/516 nm (zaļš); Hoechst 33342 krāsošanas šķīdums atbilst Ex/Em spektrālajam raksturojumam: 346 nm/460 nm (zils).

 

 

1. Kultivētām šūnām īpašo EdU koncentrāciju un inkubācijas laiku var atbilstoši pielāgot atkarībā no parauga un pētījuma mērķa.

2. Dažas audu šūnas vairojas lēni. Lai izvairītos no sliktas modelēšanas efekta, kā atsauces paraugus ieteicams atlasīt audu paraugus ar ātru proliferāciju (piemēram, zarnu audus).

3. Ja fona krāsa ir pārāk tumša, to var izraisīt eksperimentā nepietiekama mazgāšana, ilgstoša fiksācija un fiksācijas līdzekļa atlikumi utt.

4. Reaģents C (EdU katalītiskais pievienošanas reaģents) ir viegli oksidējams. Centieties izvairīties no ilgstošas ​​​​gaisa iedarbības. Pēc sagatavošanas kā ūdens šķīdums, ieteicams uzglabāt alikvotā daļā; Pārbaudīts, piemēram, EdU katalītiskās piedevas reaģenta krāsa nedaudz mainās, klikšķu reakcijas katalītiskā sistēma joprojām spēj darboties normāli. ja reaģents C ir brūns, tas norāda, ka komponentam ir beidzies derīguma termiņš, tāpēc, lūdzu, izmetiet to.

5. Jūsu veselībai un drošībai darbības laikā, lūdzu, valkājiet laboratorijas mēteļus un cimdus.

 

Tikai pētniecībai!

 

 

Populāri tagi: click-it edu-488 šūnu proliferācijas noteikšanas komplekts, Ķīna click-it edu-488 šūnu proliferācijas noteikšanas komplektu ražotāji, piegādātāji, rūpnīca